睪丸組織冷凍

精子凍存是目前男性生育力保存的主要手段，凍存的精子在一定程度上展現(xiàn)出了安全可靠的優(yōu)勢(shì)，但是在某些人群中這一手段也存在明顯的缺陷，如在患有惡性腫瘤的兒童中，其生精過(guò)程尚未啟動(dòng)，不能產(chǎn)生成熟的精子，還有一些癌癥本身會(huì)影響生精細(xì)胞的發(fā)育和成熟，在放、化療前冷凍的精子受孕率較低，此時(shí)，睪丸組織凍存就顯示出了其優(yōu)勢(shì)和必要性。

睪丸組織凍存是指通過(guò)睪丸穿刺或其他外科手段獲取睪丸組織并進(jìn)行超低溫冷凍，當(dāng)這些患者有生育需求時(shí)，可以從這些凍存的睪丸組織中直接獲取精子或?qū)⑸臣?xì)胞誘導(dǎo)形成精子，再通過(guò)試管嬰兒的方法產(chǎn)生健康后代。

睪丸組織的凍存復(fù)蘇過(guò)程都有哪些“奧秘”呢？對(duì)此臨床醫(yī)生和科學(xué)家已經(jīng)摸索出了一個(gè)相對(duì)成熟、安全有效的凍存方法。

首先，睪丸組織取材通常使用注射器穿刺的方法，這種方法只需要進(jìn)行會(huì)**的局部麻醉，然后將注射器刺人睪丸組織、通過(guò)負(fù)壓抽吸就能取得足量的睪丸組織，創(chuàng)傷較小而且恢復(fù)較快;如果睪丸穿刺取不到組織，則需要通過(guò)外科手術(shù)切取一小塊睪丸組織用于凍存。取到睪丸組織后，組織病理學(xué)檢查是非常必要的一步，因?yàn)樾枰G丸組織凍存的人群很多腫瘤患者，通過(guò)病理學(xué)檢查看看組織內(nèi)是否含有腫瘤細(xì)胞，還可以觀察睪丸組織的生精狀態(tài)和是否有成熟的精子，以備將來(lái)這些患者有生育要求時(shí)可以選擇合理的治療措施。泉州試管嬰兒

睪丸組織冷凍目前主要通過(guò)程序化降溫的方法，以4℃為起始點(diǎn)，以每分鐘1℃的速度下降到0℃，保持5分鐘;然后以每分鐘0.5℃的速度下降到-8℃，保持15分鐘;再以每分鐘0.5℃的速度下降到-40℃，保持10分鐘;最后以每小時(shí)7℃的速度下降到-80℃，然后放入液氮中保存。這樣慢速降溫的過(guò)程主要是為了能更好地將細(xì)胞中的水分脫去，因?yàn)槲覀冎浪羌?xì)胞的主要構(gòu)成物質(zhì)，在低溫狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)的水會(huì)形成冰晶，刺傷細(xì)胞器和細(xì)胞膜，而慢速降溫則能起到很好的保護(hù)作用。

在冷凍過(guò)程中，凍存的睪丸組織需要加入凍存保護(hù)劑，這些保護(hù)劑可分為滲透性和非滲透性兩大類：滲透性保護(hù)劑主要有1，2-丙二醇、乙二醇、甘油和二甲基亞砜，這些保護(hù)劑特點(diǎn)不一，如1，2-丙二醇滲透性強(qiáng)但毒性較大，乙二醇可快速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)置換細(xì)胞內(nèi)的水分，從而減少滲透激;非滲透性冷凍保護(hù)劑最常用的是蔗糖。應(yīng)滲透性和非滲透性冷凍保護(hù)劑聯(lián)合應(yīng)用可提高凍存復(fù)蘇過(guò)程中的保護(hù)效果，但這些保護(hù)劑的種類、濃度各有優(yōu)缺點(diǎn)，還需要進(jìn)一步的研究以發(fā)現(xiàn)更好的凍存方法。當(dāng)睪丸組織冷凍者有生育要求時(shí)，需要對(duì)冷凍的睪丸組織進(jìn)行解凍復(fù)蘇以恢復(fù)組織的活力。復(fù)蘇時(shí)多采用37℃水浴快速溶解，然后將冷凍保護(hù)劑洗滌干凈，還可以將復(fù)蘇后的睪丸組織進(jìn)行培養(yǎng)。

睪丸組織凍存的最終目的是保持睪丸組織中的生精細(xì)胞、支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的活力，為以后凍存者精子發(fā)生或提取精子提供保障。評(píng)價(jià)睪丸組織凍存效果主要從形態(tài)和功能兩方面人手，具體包括采用組織病理學(xué)檢測(cè)或電鏡技術(shù)，觀察精原細(xì)胞從基底膜、支持細(xì)胞和精母細(xì)胞脫離的比例來(lái)評(píng)價(jià)生精小管的損傷情況;采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)生精細(xì)胞或支持細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)情況來(lái)評(píng)價(jià)這些細(xì)胞的損傷情況;通過(guò)檢測(cè)復(fù)蘇后睪丸組織中的抑制素B和睪酮等生殖激素水平來(lái)觀察睪丸支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的功能狀態(tài)。

當(dāng)進(jìn)行睪丸組織凍存的患者治愈后，尤其是治愈的青春期前癌癥患者和隱睪癥患者到生育年齡時(shí)，有望實(shí)現(xiàn)凍存睪丸組織自體移植，以完成精子發(fā)生過(guò)程，維持這些患者的生育能力。但是該技術(shù)有可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的再回輸，腫瘤細(xì) 胞重新生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移從而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)，因此我們上面提到的組織病理學(xué)檢查十分必要。

目前含有成熟精子的睪丸組織凍存后復(fù)蘇用于輔助生殖技術(shù)已經(jīng)相對(duì)成熟，臨床研究認(rèn)為這些冷凍的睪丸組織中提取的精子進(jìn)行試管嬰兒的成功率與新鮮精子無(wú)明顯差別。2014年，一位身患腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤的9歲小男孩Nathan進(jìn)行了睪丸組織冷凍手術(shù)， 由于這種神經(jīng)膠質(zhì)瘤很難通過(guò)手術(shù)摘除，只能進(jìn)行強(qiáng)制化療，而化療將會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的副作用，包括睪丸組織的損傷和生殖細(xì)胞的丟失。

這位小患者的主治醫(yī)生給出這樣的建議：“我們可以通過(guò)睪丸組織冷凍的方法來(lái)幫助Nathan實(shí)現(xiàn)當(dāng)父親的愿望， 這種方法沒有字面上看起來(lái)那么可怕， 我們只是從Nathan的睪丸上切下一部分含有精子干細(xì)胞的組織，就像從橘子上單獨(dú)掰下一瓣一樣。腫瘤治療完成后，在他未來(lái)想成立自己的家庭、生育后代時(shí)，我們?cè)偻ㄟ^(guò)手術(shù)將這塊冷凍的組織重新植人他的身體，他就能實(shí)現(xiàn)成為一名父親的愿望了”。在此之前，日本科學(xué)家在實(shí)驗(yàn)室中首次利用超低溫冷凍的睪丸組織成功培育出了小鼠后代。他們通過(guò)兩種不同的凍存方法緩慢冷凍法和玻璃化法保存了新生小鼠的睪丸組織，將超低溫保存的組織解凍后進(jìn)行組織培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其中的細(xì)胞能夠保持分化成精子的能力，而且精子生成的效率與新鮮組織一樣高。在小鼠中，研究者利用超低溫保存了4個(gè)月的睪丸組織，用圓形精細(xì)胞注射技術(shù)和人工授精技術(shù)進(jìn)行了微授精，最終共發(fā)育成8個(gè)可育后代。這些來(lái)自超冷組織的的小鼠能夠健康成長(zhǎng)，并且新生小鼠的生育力也完全正常。雖然這種冷凍睪丸組織中生殖細(xì)胞發(fā)育成成熟精子的研究在人身上尚未開展，但它的技術(shù)原理和卵巢組織冷凍技術(shù)相通，后者已有多例在人身上成功的報(bào)道，所以我們相信在不久的將來(lái)冷凍睪丸組織中的生精細(xì)胞發(fā)育成精子一定也能夠成功。

睪丸組織凍存因其明顯的優(yōu)勢(shì)有著廣闊的應(yīng)用前景，但凍存復(fù)蘇后的組織移植和培養(yǎng)仍需要科學(xué)家進(jìn)一步的研究探索。盡管這一領(lǐng)域的研究剛剛起步，目前還有許多有待克服的難題，但將來(lái)有望給不育患者帶來(lái)福音。